三、DHA生產(chǎn)理論研究

1、DHA的代謝途徑

1.1 DHA的分解代謝

天然不飽和脂肪酸多為順式，需轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)型,才能被β-氧化酶系作用，進一步氧化分解。在生物體內(nèi)，不飽和脂肪酸的氧化需要更多酶的參與才能順利進行，由于雙鍵的存在，使DHA比飽和及單不飽和脂肪酸更難氧化分解。DHA不能在線粒體中β-氧化，而是被過氧化物酶體氧化，皮膚表皮15-脂氧合酶的活性非常高，將DHA轉(zhuǎn)化為17-羥基二十碳六烯酸。DHA被哺乳動物吸收后，絕大部分結(jié)合成甘油三酯。

1.2 DHA的合成代謝

哺乳動物自身不能合成DHA，但可由攝食的油酸、亞油酸或亞麻酸轉(zhuǎn)化而成。在動物體內(nèi)，攝食的油酸或亞油酸主要轉(zhuǎn)化為AA，而合成的DHA極少且緩，人體內(nèi)DHA主要由植物油亞麻酸轉(zhuǎn)化而來，由于轉(zhuǎn)化涉及3種酶（其中△6去飽和酶為限速酶）的代謝過程，因此轉(zhuǎn)化效率較低。

微生物合成多價不飽和脂肪酸通常是在單不飽和脂肪酸基礎(chǔ)上開始，合成機制與高等生物一致，包括延長碳鏈和去飽和作用兩個過程，分別由相應的膜結(jié)合延長酶和脫飽和酶催化，使碳鏈增長；脂肪酸脫飽和體系由微粒體膜結(jié)合的細胞色素 b5、NADH-細胞色素b5還原酶和脫飽和酶組成。微生物合成 DHA是從油酸開始，其脫飽和途徑是ω-3；供體（乙酰CoA或丙二酰單酰CoA）提供兩 個碳原子，在 12、13位C原子之間引入一個雙鍵，形成亞油酸，再在15、16位碳原子間引入一個雙鍵， 形成α-亞麻酸，再經(jīng)進一步的碳鏈延長和脫飽和而形成DHA.

2、影響微藻培養(yǎng)生產(chǎn)DHA 的理化因素

2.1 物理因素

影響微藻生長生產(chǎn)DHA的物理因素有光照、溫度、溶氧量、鹽度、pH值等。

（1）光照：脂肪酸的合成具有藻種的特異性。

（2）溫度：不同的溫度對藻細胞的生長具有較大的影響。隨溫度的升高，藻細胞的代謝和呼吸作用加快，生長速率增大。而隨溫度的減低，藻細胞的代謝和呼吸作用降低。細胞內(nèi)的多不飽和脂肪酸累積量逐漸增大，DHA含量也逐漸增大。

（3）鹽度：鹽度對微藻脂肪酸組成的影響因種而異。一般來說，在高鹽濃度下，多不飽和脂肪酸的含量下降。而在適宜的鹽度時，DHA含量隨著鹽度的升高而增大。

（4）溶氧量：在脂肪酸的代謝途徑中，分子氧參與脂肪酸的去飽和過程是多不飽和脂肪酸合成過程的限制因子，微藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的含量也受氧濃度的影響。一般來說，高濃度的溶氧中生產(chǎn)的DHA含量大于低濃度中的DHA含量。

（5）pH值：不同的微藻都有其適宜的pH值。它不僅影響了微藻細胞內(nèi)外的離子平衡，也影響了藻細胞膜的通透性。

此外，培養(yǎng)周期、培養(yǎng)密度、保存方式也對微藻生產(chǎn)DHA有影響。

2.2 化學因素

（1）碳氮比：培養(yǎng)基中的氮源組成主要影響微藻細胞內(nèi)飽和及不飽和脂肪酸的比例，當培養(yǎng)基中C/ N比升高時，Chlorellasorokiniana細胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的含量增大。同時培養(yǎng)基的碳、氮源的選擇也影響了微藻生產(chǎn)DHA的產(chǎn)量，這表現(xiàn)為不同的藻種對碳、氮源有不同的適應性。

（2）氯化鈉：在海洋藻類中，鈉離子的作用主要是調(diào)節(jié)細胞生長中胞內(nèi)外的滲透壓。在高鹽濃度下，藻細胞的細胞膜的流動性和滲透壓降低，多不飽和脂肪酸含量下降，DHA的含量也下降，而低鹽度下時DHA的含量較高。

2.3 微藻生產(chǎn)DHA的方式

（1）自養(yǎng)方式

對光合自養(yǎng)的微藻進行研究，發(fā)現(xiàn)一些光合自養(yǎng)微藻能產(chǎn)生 DHA。如光甲藻和隱甲藻中，DHA是磷脂酰膽堿的主要成分，特別是隱甲藻體內(nèi)，將近總脂肪酸的50%的成分為 DHA。人們也已經(jīng)從海藻中發(fā)現(xiàn)DHA，含量占總脂肪酸的12%~36%。光合自養(yǎng)微藻的大規(guī)模培養(yǎng)多采用開放式池、封閉式池和封閉式光合生物反應器系統(tǒng)進行培養(yǎng)。

（2）異養(yǎng)方式

與自養(yǎng)培養(yǎng)方式相比，其具有培養(yǎng)過程無需光照，減少能量；可具有較大的培養(yǎng)密度，可提高底物的轉(zhuǎn)化率，縮短了發(fā)酵周期;能控制溫度、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)。

目前，已經(jīng)成功地進行了隱甲藻異養(yǎng)及混養(yǎng)的研究。

2.4 影響真菌合成DHA的因素

2.4.1 培養(yǎng)基的組成

（1）碳源：真菌發(fā)酵生產(chǎn) DHA時，不同的碳源對生物量、菌體脂質(zhì)量和脂質(zhì) DHA含量都有極大的影響。總體而言，葡萄糖是較佳的碳源，生物量、菌體脂質(zhì)量、脂質(zhì)DHA含量以及DHA產(chǎn)量都是較高的。葡萄糖也是油脂發(fā)酵生產(chǎn)中***常使用的碳源，而且可被有效轉(zhuǎn)化為油脂。

（2）氮源：氮的數(shù)量和來源對真菌合成多不飽和脂肪酸有著重要的影響。酵母抽提物、 谷氨酸鈉和胰蛋白胨有利于Thraustochytriumaureum ATCC 34304的生長，其中以酵母抽提物的生物量******，谷氨酸鈉還有利于脂質(zhì)的積累，各種氮源對脂質(zhì)DHA的含量影響不是十分明顯，從DHA的產(chǎn)量看，酵母抽提物和谷氨酸鈉為較好的氮源。

（3）碳氮比：除了碳源、氮源外，培養(yǎng)基中碳氮比也影響真菌合成DHA。 微生物生長于碳源過剩、氮源不足，或者是剝奪氮源的環(huán)境，便會激發(fā)和促進脂質(zhì)的積累作為碳及能源的備用庫。一般情況下高的碳氮比有利于脂質(zhì)的積累和促進菌體的生長，但碳氮比過高，脂質(zhì)中DHA含量將會下降。

（4）無機鹽及微量元素：在培養(yǎng)海洋微生物時，除非培養(yǎng)基中含有足夠的所有必需微量元素，否則，較好采用天然海水。由于破囊壺菌和裂殖壺菌均為海生真菌，因此培養(yǎng)基中添加一定量無機鹽是非常必要的。

（5）前體促進劑：一些有機酸和維生素對真菌合成 DHA也是十分有用的 。

2.4.2 通氣與攪拌

微生物合成多不飽和脂肪酸過程中的去飽和作用需要分子氧的參與，分子氧的有效性決定其產(chǎn)生脂肪酸的不飽和度。因此，提高培養(yǎng)基中氧濃度有利于不飽和脂肪酸的合成。機械攪拌對培養(yǎng)Thraustochytrium 和 Schizochytrium 生產(chǎn)DHA有不同的影響。由于Thraustochytrium缺乏細胞壁和富含不飽和脂肪酸，細胞脆性大，機械攪拌抑制其生長。 但Schizochytrium的情況則不同，適當提高攪拌速度能促進菌體的生長。另外，攪拌器的葉輪類型對菌體的生長也有影響。

2.4.3 初始pH值

真菌生產(chǎn)DHA時,選擇適宜的初始 pH值也是十分重要的。

2.4.4 溫度對DHA的生產(chǎn)有著極其重要的影響

嗜冷微生物比嗜溫微生物能合成更多的多不飽和脂肪酸。許多研究也表明， 低溫能促進微生物合成不飽和脂肪酸。Brown和Rose認為，由于低溫增加氧的可溶性，產(chǎn)生大量胞內(nèi)分子氧，有利于需氧參與的長鏈脂肪酸的去飽和作用。另外，低溫下，微生物產(chǎn)生大量多不飽和脂肪酸也是一種適應低溫環(huán)境的手段，因為多不飽和脂肪酸，特別是EPA、DHA能保持微生物細胞膜低溫流動性，從而維持細胞正常功能。

2.4.5 種齡和接種量

種齡顯著影響Thraustochytriumaureum ATCC34304的脂質(zhì)積累和 DHA產(chǎn)量，對生物量和脂質(zhì)DHA含量影響不大，種齡24h和5%的接種量時脂質(zhì)積累和 DHA產(chǎn)量******。

2.4.6 光照

破囊弧菌和裂殖弧菌為具有光刺激生長特性的海生真菌，因此，光照對其生產(chǎn)DHA也有影響，Thraustochytriumaureum ATCC34304在33W 熒光燈光照下的生物量、脂質(zhì)量和DHA產(chǎn)量都比黑暗培養(yǎng)時高。

2.4.7 培養(yǎng)時間

破囊弧菌和裂殖弧菌發(fā)酵初期的生物量和脂質(zhì)量呈線形增加，至對數(shù)生長末期達到******，此后，生物量保持平穩(wěn)，而脂質(zhì)量有所下降。DHA含量隨培養(yǎng)時間變化并不明顯。

目前，研究多不飽和脂肪酸的合成途徑、去飽和酶基因的性質(zhì)、藻細胞內(nèi)脂肪酸的組成、分布、DHA合成的途徑及合成前體物質(zhì)等也為多不飽和脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更多的理論基礎(chǔ)。

四、DHA的分離提取

1、低溫分級法

利用不同的脂肪酸在過冷的有機溶劑中的溶解度差異來分離濃縮 DHA。即將總脂肪酸置于1~10倍的無水丙酮中 ,并冷卻至-25℃以下，混合液的下層為飽和的脂肪酸和低度的不飽和脂肪酸結(jié)晶，而上層含有大量的高度的不飽和脂肪酸的丙酮溶液，將混合液過濾，濾液在真空下蒸餾除去丙酮，就可得到較純的DHA。

2、溶劑提取法

利用不同脂肪酸的金屬鹽在某種有機溶劑中的差異來分離濃縮DHA。該種方法是通過皂化后，在皂液加入H2SO4，并將pH調(diào)至1~2 ，分離上層粗脂肪酸乙醇混合液，加入回收乙醇，并反復水洗粗脂肪酸至pH為中性。即可得相對較純的DHA。

3、尿素包合法

脂肪酸與尿素的結(jié)合能力取決于其不飽和程度，脂肪酸的不飽和程度越高，其于尿素結(jié)合的能力越弱。因而可將飽和脂肪酸、低度不飽和脂肪酸、高度不飽和脂肪酸分離開來。然后，利用適當?shù)娜軇┹腿�，真空干燥后可得�?/span>DHA含量較高的不飽和脂肪酸。

4、超臨界 CO2萃取法

超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，簡稱 SFE)是近代發(fā)展起來的一種新型化工分離技術(shù)。它原理主要是將DHA溶于超臨界狀態(tài)的CO2中，通過改變溫度和壓力，達到分離DHA的目的。它能夠分離出較純的DHA，但是對含有相同的碳數(shù)而雙鍵不同的脂肪酸卻效果較差。此外，現(xiàn)在還具有脂肪酶水解法、膜分離法、硝酸銀層析法、******液相色譜法等。

5、酶法破碎

細胞破碎的方法而言可分為機械法和非機械法，機械法包括珠磨法、高壓勻漿法、超聲波法和微波法等；非機械法包括溶酶法、酸熱法和自溶法等。

酶解法是一種研究較廣的細胞破碎方法，它利用酶反應，分解破壞細胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。

自溶法是一種特殊的溶酶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。事實上，在微生物生長代謝過程中，大多都能產(chǎn)生一定的水解自身細胞壁上聚合物結(jié)構(gòu)的酶，以便使生長繁殖過程進行下去�？刂埔欢�條件，可以誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。目前常用的自溶促進劑有食鹽、乙醇、甲苯、硫醇等。某些試驗是通過在菌液加入NaCl使其達到一定的濃度進行處理的。不溶固形物的含量隨處理時間延長而減少，這是因為NaCl溶液中，存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，引起細胞膜發(fā)生破裂，使得細胞水解酶與底物接觸而被激活，分解細胞，原生質(zhì)外溢，胞內(nèi)產(chǎn)物釋放致使不溶固形物減少。

自溶作用是酶解的另一種方法，在一定程度上能用于工業(yè)生產(chǎn)，但對不穩(wěn)定的微生物則容易引起蛋白質(zhì)變性，自溶后細胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。

其使用方法為：溶菌酶是專門作用于微生物細胞壁的水解酶，酶解條件為：pH值7·2的0·2 mol·L-1的磷酸鉀緩沖溶液， 0·8 mol·L-1的氯化鉀溶液，0·5%的溶菌酶。在30℃將菌體振蕩不同時間后離心，菌體酶解后加入丙酮。影響因素：溫度、PH、自溶時間等對自溶效果都有影響，根據(jù)菌體的不同而有不同的影響。

酶法破碎的缺點：酶法避免了大量有機溶劑的使用，但酶作用的條件比較苛刻，這給過程的操作帶來麻煩。

目前很多是將酶法與其它各種細胞破碎方法結(jié)合起來，如酶解-超聲波法，酶解-高壓破碎法等。